落叶松(Larix ssp.)为松科(Pinaceae)落叶松亚科(Laricoideae)落叶松属(Larix Mill)针叶用材造林树种，可以作为多种工业用材，分布广泛，并以早期速生而著称，是北半球温带与寒温带地区重要的经济和生态树种。目前落叶松以传统育 种为主，但由于其生长周期长，具有高度杂合性，遗传操作难度大，育种周期长，传统育种技术远远不能满足生产的需求。建立高效稳定的落叶松遗传转化体系，对 其品质改良，加速遗传育种进程具有十分重要的意义，也是研究外源基因在落叶松体内表达调控及功能的重要前提。

利用抗生素筛选转化体和抑制 细菌生长是遗传转化工作中的重要内容。在筛选阶段，选择压偏大不利于转化体的生长，从而导致转化率偏低甚至转化失败；选择压偏小，将导致大量的假阳性转化 体产生，给以后的转化体筛选以及分子检测工作带来不便。农杆菌介导的遗传转化中，受体材料与农杆菌共培养后，农杆菌过度生长造成的污染将导致遗传转化失 败，因此需要在培养基中添加合适的抗生素抑制农杆菌的继续生长，从而避免细菌污染。研究表明，植物不同基因型对抗生素敏感反应不同(范正琪等, 2005)，同种植物材料对不同的抗生素反应也存在差异(康薇等, 2008; 郑树松等, 2002)。因此对受体材料对抗生素的敏感性进行研究以确定遗传转化中合适的抗生素种类及使用浓度，从而降低筛选难度，避免细菌污染，同时不影响转化体的正常生长，是进行遗传转化并提高转化效率的保障。遗传转化中使用的抗生素按照用途分主要有筛选抗生素和抑菌抗生素两类。卡那霉素(Kanamycin, Km)属于氨基葡萄糖苷类抗生素，由于Km对细胞具有强烈的毒害作用，致使大量的非抗性受体材料经选择培养后便慢慢死亡，因此Km经常被用作植物遗传转化中的筛选抗生素。头孢霉素(Cefotaxime, Cef)和羧苄青霉素(Carbenicillin, Cb)等常用作植物遗传转化中的抑菌抗生素。大量遗传转化研究表明，300-500 mg的抑菌抗生素能够达到很好的抑菌效果(Cerda等, 2002; Hiei等, 2006; Nigroa等, 2008)。

植物体细胞胚胎是由胚性细胞发育而来，具有很强的接受外源DNA 的能力，体细胞胚多是单细胞起源，转化获得的转基因嵌合体较少，是理想的基因转化感受态细胞(陈英等, 2006)。在针叶树的遗传转化研究中，用做转化的受体材料主要有胚性细胞、体细胞胚、下胚轴、原生质体、种子、合子胚、茎、花粉等，但是转化成功的报道 中以胚性细胞为受体材料居多，例如以胚性细胞为受体材料对辐射松(Pinus radiata)、火炬松(Pinus taeda)、挪威云杉(Picea abies)、黑云杉(Picea mariana) 进行遗传转化已经获得了稳定表达的转基因植株(陈少瑜等, 2006)。因此高效的体胚再生系统是比较理想的遗传转化受体系统。目前本课题组已经建立了稳定高效的落叶松体细胞胚胎发生的体系(齐力旺, 2000)，是落叶松遗传转化的优良受体系统，关于落叶松遗传转化的研究可以开展。然而抗生素对落叶松细胞系生长影响作用尚不清楚，相关的研究至今为止鲜 有报道。本文研究了Km、Cef、Cb对落叶松胚性细胞系增殖与恢复生长的影响，目的在于确定落叶松胚性细胞系遗传转化研究中合理的抗生素使用方案，为建 立基于落叶松体细胞胚胎发生技术的高效遗传转化体系奠定基础。

1结果与分析
1.1 Km处理下细胞系638的生长
胚性组织于含有不同浓度Km的增殖培养基培养30 d后，生长情况趋于稳定。经观察，组织对Km的反应比较敏感。随着Km浓度的增加，接种组织产生新生细胞数量逐渐减少，生长状态也越来越差(图1)。当 Km浓度为15 mg/L时，组织生长开始受到明显的抑制，呈现褐色，表面仅有少数的存活细胞；当浓度为20 mg/L时，组织褐化现象严重并呈水渍状，表面只有零星细胞存活。随着浓度的增大(≥25 mg/L)，组织呈严重水渍状，完全失去再生能力且逐渐死亡。经过对组织增殖率的统计得知，随着Km浓度的增大，组织增殖率逐渐下降；用LSD法对组织增 殖率进行多重比较结果表明(见表1)，胚性组织在Km的作用下增殖率与对照存在显著性差异，Km浓度≥25mg/L的处理间无显著差异。结合Km作用下组 织生长状态及组织增殖率分析，Km浓度为25 mg/L时细胞系638耐受性已经达到临界程度。

图1 不同浓度Km作用下, 胚性细胞系638的生长状态 Figure 1 Effect of Km at different concentrations on proliferation of cell line 638

表1 不同浓度Km对3种细胞系组织增殖率的影响(LSD法) Table 1 LSD multi-comparisons of effect of Km on tissues proliferation

1.2 Km处理下细胞系109的生长
统计结果表明，随着Km浓度的增大，细胞系109组织增殖率逐渐降低。对不同浓度Km处理下胚性组织的增殖率进行LSD法多重比较(见表1)得出，各处理与对照存在显著性差异，较高浓度(15-25 mg/L)的各处理差异不显著。通过观察各处理下胚性组织生长状态可知，当Km浓度为15 mg/L时，组织已经开始受到严重的伤害；浓度≥20 mg/L时，生长完全被抑制，且全部死亡。由此看来，细胞系109对Km耐受性临界浓度为20 mg/L。

1.3 Km处理下细胞系113的生长
细胞系113对Km的反应与另外两个细胞系相比更加敏感。经Km处理后，该细胞系组织增殖率明显低于不经处理的组织。LSD法多重比较结果表明(表1)：胚 性组织在Km的作用下增殖率与对照存在显著性差异；不同浓度Km作用下，胚性组织的增殖率无显著差异。通过观察发现，在浓度为10 mg/L的Km作用下，胚性组织几乎全部死亡。当浓度≥15 mg/L时，胚性组织完全不具有耐受能力而全部死亡。因此细胞系113耐受性临界浓度值15 mg/L。

1.4 Cef和Cb对落叶松细胞系生长的影响
继代培养基中抗生素浓度为300-500 mg/L时，胚性细胞系109在2种抗生素作用下的生长状态(图2)及组织增殖率(图3)表现不同。在Cef的作用下，胚性组织呈白色透明状，生长旺盛， 增殖率高于对照，且随着Cef浓度的增加呈平缓的上升趋势。Cb对胚性组织具有明显的毒害作用：浓度为300 mg/L时，胚性组织呈现水渍状，部分死亡；随着浓度的增加，组织死亡程度加重，增殖率逐渐下降。由此可见，Cef和Cb对细胞系109的生长影响不同： Cef起促进作用，而Cb则具有抑制作用。因此，为避免转化组织生长受到抑制，在以细胞系109为受体材料的遗传转化中，选用Cef用于抑菌处理比较合 理。

图2 Cef和Cb作用下, 细胞系109生长状态 Figure 2 Effects of Cef and Cb on proliferation of cell line 109

图3 Cef和Cb对细胞系109增殖生长的影响 Figure 3 The effects of Cef and Cb on proliferation of cell line 109

2讨论
2.1落叶松胚性细胞系对Km的敏感性反应
落叶松胚性细胞系对Km反应比较敏感。在较低浓度(10 mg/L)的Km作用下，各细胞系生长不良，当培养基中Km浓度≥25 mg/L时，胚性组织全部死亡。Km的作用下各细胞系的组织增殖率明显低于对照，且与对照存在显著的差异。

3 种细胞系对Km的敏感性反应不同。细胞系113对Km作用反应最敏感，109次之，638相对来说不太敏感，对Km的耐受临界浓度分别为15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L。在其他研究中也表明，不同基因型的外植体对Km敏感性存在差异。如范正琪等(2005)对不同浓度Km作用下2种油茶愈伤组织敏感性反应的研究 表明，浙江红山茶对Km的敏感性高于大花红花油茶。Km对浙江红山茶的致死浓度为50 mg/L，而对大花红花油茶愈伤组织的致死浓度为60 mg/L。

与其他植物的胚性细胞系相比，落叶松胚性细胞系对Km反应更加敏感。通过以上分析，3种落叶松细胞系对Km的耐受临界浓度在10-25 mg/L范围内，低于其他植物胚性细胞系对Km的耐受临界浓度。如黄天带等(2008)研究Km对巴西橡胶树花药愈伤组织生长与分化的影响，得出Km为 50 mg/L时完全抑制组织的生长，但不致死。郑树松等(2002)的相关研究表明，Km对棉花愈伤组织的生长具有抑制作用，浓度大于50 mg/L时，愈伤组织增长量变化不再明显。胡桂兵等(2001)用不同浓度的Km处理台湾青枣茎段愈伤组织生长，通过实验发现即使是用含50 mg/L Km的培养基对胚性组织进行继代培养，也无法将外植体全部杀死。由此看来，落叶松胚性细胞系相对于其他植物来说，对Km的反应比较敏感，这可能与针叶树自 身生物特性有关。

另外，值得指出的是在遗传转化中，转化体由于已经受到伤害，在耐受临界浓度的Km的作用下很难恢复生长从而导致转化率降低，因此筛选培养基中Km的浓度应稍低于细胞系的Km耐受临界值。

2.2不同抑菌抗生素对细胞系生长的作用
本文关于Cef和Cb对落叶松细胞系生长的影响的研究表明，2种抗生素对细胞系生长作用不同，Cef促进胚性细胞系109的生长，而Cb则抑制其生长，因此 对于胚性细胞系109为受体的遗传转化研究，Cef是比较合适的抑菌抗生素。其他关于Cef和Cb对植物材料生长影响的研究中有不同的结果。如康薇等 (2008)研究发现Cef对刺槐离体培养的外植体毒性比Cb大，Cb只在高浓度(500 mg/L)才对不定芽的分化有抑制作用。郑树松等(2002)研究发现Cef和Cb对棉花下胚轴切段诱导的愈伤组织生长没有明显的影响。因此，抑菌抗生素 对植物材料生长的影响作用因植物类型不同而存在差异。

通过本研究，明确了不同抗生素对部分落叶松胚性细胞系生长的影响，给落叶松遗传转化研究中筛选抗生素及抑菌抗生素和其浓度的使用提供了参考，为遗传转化工作的顺利进行奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
采用生长优良的落叶松胚性细胞系638(日本落叶松, Larix leptolepis)、109(长白落叶松, L. olgensis)、113(日本落叶松, L. leptolepisi)作为供试材料。3种胚性细胞系均为从辽宁省大孤家落叶松种子园采集的材料利用齐力旺(2000)关于华北落叶松体细胞胚胎发生的技术经过诱导和多次继代培养获得的胚性组织。

3.2培养基
诱导及继代基本培养基为S(Ewald et al., 1996)；诱导培养基为S+VB₁ 0.5 mg/L+BA 0.4 mg/L+2,4-D 1.1 mg/L+KT 0.4 mg/L，继代培养基为S+B(HBO₃由S的3.1 mg/L增加至7.5 mg/L)+VB₁0.5 mg/L+BA 0.4 mg/L+2,4-D 0.4 mg/L；另外两种培养基中再添加谷氨酰胺450 mg/L，酸水解酪蛋白500 mg/L，肌醇1 g/L，蔗糖30 g/L，琼脂(Sigma^#)3g/L，pH5.8。

3.3试验方法
本研究中筛选抗生素为Km，试验对象为胚性细胞系638、109、113。将各细胞系胚性组织均接种于添加Km的继代培养基上进行培养。培养基中Km浓度分 别为10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L，以不添加抗生素为对照，共7个处理。各细胞系每个处理设置5个重复(即分别接种5个培养皿)，每个重复接种约1.0 g胚性组织。

抑菌抗生素为Cef和Cb，试验对象为胚性细胞系109。继代培养基中添加Cef或Cb 300、400、500 mg/L，以不添加抗生素为对照，共7个处理。其他试验方法同上。

 Km 和Cb均购于北京欣经科生物技术有限公司，Km为Merck分装，Cb为国产分装。Cef购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司国产分装。Km经无菌水溶解配制50 mg/ml的母液，过滤灭菌后于-20℃保存。Cef和Cb瓶装粉末4℃保存。培养基高压灭菌后冷却至约60℃时添加所需抗生素备用。

3.4试验统计分析
30 d后观察记录胚性组织状态及再生情况，统计处理前后接种组织重量并计算胚性组织增殖率(以下称组织增殖率, 计算方法见下面公式)，数据使用数理统计软件SPSS 16.0进行统计分析。
组织增殖率(%)=(处理后组织重量-接种重量)/接种重量×100

作者贡献
朱彩虹、栗婷是本研究的实验设计和实验研究的执行人；朱彩虹完成结果分析，论文初稿的写作；韩素英指导实验研究的实施；齐力旺是项目的负责人，指导实验设计，结果分析，论文写作与修改。全体作者均已阅读并同意论文最终文本。

致谢
本研究由国家“973”项目(2009CB119100)，国家自然科学基金重点项目(30830086)，国家“863”项目(2006AA100109, 2007AA10Z182, 2008AA10Z126, 2007AA100105)和国家林业局948项目(2007-4-03)资助。

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